抗衰老中药对自由基清除作用的研究进展的论文
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篇1：抗衰老中药对自由基清除作用的研究进展的论文
关于抗衰老中药对自由基清除作用的研究进展的论文
【摘要】综述了抗衰老中药的抗氧化成分和抗氧化机制，提出了今后尚待研究的问题，对抗衰老中药进一步研究和开发具有重要意义。
【关键词】抗衰老 中药 自由基
Progress of studies for scavenging free radical on antiaging traditional Chinese medicine
【Abstract】This paper reviewed antiaging traditional Chinese medicine which have the antioxidative components and mechanism.The future developing direction in this fileld was proposed and further studies on antiaging traditional Chinese medicine is worth making.
【Key Words】Antiaging ；traditional Chinese medicine；free radical
1956年英国学者Harman在前人研究工作的基础上向科学界正式提出衰老自由基理论[1]。该理论认为引起人类衰老的主要原因是细胞在代谢过程中不断产生自由基。自由基是一类性质活泼、具有极强氧化能力的化学物质。机体代谢过程中产生的不稳定自由基在细胞内堆积，引起不饱和脂肪酸氧化成过氧化物，形成脂褐素（lipofuscin,LF），并使细胞及其重要成分如DNA、蛋白质和酶类等改变或破坏，导致机体衰老。衰老是机体自然代谢过程中的一个必然阶段，是随年龄增长而产生的一系列生理学和解剖学方面的变化，主要表现为机体对内外环境适应能力逐渐减退以至丧失，是生物体在生命后期阶段所出现的进行性、全身性、多因素共同作用的循序渐进的退化过程。人体本身也能产生防御自由基损害的物质。然而，随着年龄增加产生这些物质的能力会逐渐降低，对自由基损害的防御能力下降，导致衰老加速。与人工合成的自由基清除剂相比，中药抗氧化剂具有经济和毒、副作用小的优点。大量研究证实，很多具有抗衰老的中药能提高机体抗氧化酶的活性，减少自由基对机体的损伤，发挥其抗衰老功能。本文对抗衰老中药的有效成分和自由基清除作用的研究情况作一综述。
1 黄酮类（Flavonoids）
黄酮类化合物是指二个苯环通过一个三碳链构成的环相连的一类化合物总称。根据其结构可分成黄酮、黄酮醇、二氢黄酮(醇)、异黄酮、双黄酮、查耳酮、黄烷醇等10个类别。因其化学结构中含有酮基，天然黄酮类化合物一般为金黄色或淡黄色，所以称之为黄酮。芸香甙、槲皮素及异槲皮甙清除氧自由基（O2- ·）和羟自由基（OH·）的作用强于标准的自由基清除剂VitE[2]。金丝桃甙可抑制心脑缺血及红细胞自氧化过程中的丙二醛(MDA)产生，显著提高大鼠血浆、脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）等抗氧化酶的活性[3]。黄芪总黄酮有清除O2- ·和OH·防止生物膜过氧化的作用，也能显著抑制OH·对DNA的损伤作用，是黄芪抗氧化作用的主要成分[4]。从银杏叶、夏枯草提取的黄酮能有效改善阿茨海默等退行性病变[5]。其他一些黄酮类化合物如白花蛇舌草黄酮、甘草黄酮、沙棘总黄酮、艾纳香二氢黄酮等均有清除自由基或抗脂质过氧化作用。淫羊藿黄酮能够显著恢复D一半乳糖衰老模型小鼠T和B淋巴细胞增殖反应的功能，同时提高肝脏总SOD的活性，减少心、肝等组织的过氧化脂质（LPO）形成[6]。Husain等人证实了十二种黄酮类化台物对OH·的清除作用，并推论只有其B环上的羟基被取代时才具有此作用[7]。黄酮类化合物的抗氧化作用强弱与其结构有关，黄酮醇的抗氧化能力强于黄酮，B环上具有3ˊ，4ˊ邻二酚羟基的黄酮抗氧化性能最好。在B环无抗氧化作用时，A环上邻苯二酚结构可以补偿并起重要的抗氧化作用[8]。黄酮类化合物清除氧自由基的作用至少有三种途径：通过酚羟基与自由基进行抽氢反应生成稳定的半醌自由基，从而中断链式反应以完成抗氧化作用；通过抗氧化剂的还原作用直接给出电子而清除自由基，同时能显著提高SOD和GSH-Px活性并对过氧化氢（H2O2）的生成有明显的抑制作用；通过抗氧化剂对金属离子的络合，降低若干需金属离子催化的反应，从而间接实现抗氧化作用[9]。黄酮类化合物在抗氧化反应中既能消除链引发阶段的自由基，也能直接捕获自由基反应链中的自由基，通过酚羟基阻断自由基链反应[10]。
2 酚类物质（Phenolics）
多酚类化合物是极好的氢或电子供体，由于形成的酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置，因此不会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化，所以是很好的抗氧化剂。阿魏酸(ferulic acid)分子苯环上的酚羟基是抗氧化活性基团，可清除自由基，抑制氧化反应和自由基反应，以及与生物膜磷脂结合保护膜脂质结构和功能[11]。阿魏酸还可直接减少H2O2含量，但对MDA含量无减少作用。绿原酸(chlorogenic acid,CHA)是由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(quinic acid)组成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。CHA和3,5-二咖啡酰奎尼酸(DCQA)均属于小分子化合物，能与过氧自由基快速反应，对2,2′-二苯基-α-苦基肼基(DPPH)自由基显示清除活性。CHA主要存在于杜仲科、忍冬科忍冬属、菊科蒿属等中草药中。橄榄油富含多酚类化合物，如松脂醇(C20H22O6)和乙酰松脂醇(C22H24O8)。经常食用橄榄油能有效的防止因脂肪过氧化而发生的细胞凋亡所带来的`早衰、早老、色斑、皱纹等[12]。原花青素（procyanidins,PC）是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。PC主要分布在下列中草药中：银杏、大黄、山楂、耳叶番泻、小连翘、葡萄、日本罗汉柏等，其最为突出的特点是能够扑获细胞外液中的活性氧，抑制低密度脂蛋白（LDL）氧化，表现出抗动脉粥样硬化的活性[13∽14]。
3 多糖(Polysaccharides)
许多中药富含活性多糖，因而具有促进机体免疫、抗肿瘤、抗细菌、抗病毒、抗寄生虫以及抗辐射等作用，临床主要用于治疗肝炎、癌症、艾滋病和抗衰老等。如人参多糖、黄芪多糖的免疫增强作用，香菇、猪苓多糖的抗肿瘤作用，银耳多糖的保护肝细胞作用，芦荟多糖的抗肿瘤和抗艾滋病毒作用等，都与其抗氧化作用密切相关。黄芪多糖可明显增强创伤小鼠体内的SOD活性，抑制创伤后体内自由基诱发的脂质过氧化反应[15]。灵芝多糖口服液可增强GSH-Px、SOD活性，抑制脂质过氧化，对阿霉素引起的细胞自由基损伤大鼠有一定的保护作用[16]。南沙参多糖对化学药品引起的小鼠学习记忆障碍有明显改善作用，对小鼠脑中MDA升高、SOD减少有抑制作用，表明南沙参多糖改善小鼠学习记忆作用与影响脑中自由基有关[17]。枸杞多糖能明显增强小鼠全血、肝、肌肉组织的SOD活性，升高肝组织GSH-Px、GSH的含量，促进小鼠体内氧自由基的清除。多糖抗氧化机制主要是加强DNA的复制与合成，提供必需的微量元素与营养来延长动物的生长期；提高动物对非特异性刺激的抵抗能力，通过调节和增强免疫功能达到抗衰老作用；通过调节蛋白质、核酸、糖和脂质代谢，抗脂质过氧化与抑制LF形成，提高机体SOD比活力，清除LPO和MDA、抑制单胺氧化酶B（MAO-B）的活性作用以发挥抗衰老功能[18]。
4 皂苷(Saponin)
皂苷是存在于植物界的一类较复杂的苷类化合物。因其水溶液形成持久泡沫，象肥皂一样而得名。皂苷类根据苷元的化学结构分为甾体皂苷和三萜皂苷两类，各类皂苷中以三萜皂苷分布最为广泛。近年来研究表明，皂苷大多具有明显的抗氧化作用，已知氧化损伤与许多病理生理现象如衰老、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等有关，皂苷类的抗氧化作用则可能是其延缓衰老，抗动脉粥样硬化，抗缺血再灌注损伤等药理作用的共同作用机制[19]。甘草次酸能显著抑制CCl4诱导肝的微粒体不饱和脂肪酸过氧化作用，其抑制强度高于Vit E[20]。具有抗氧化活性的皂苷类还有三七皂苷、西洋参皂苷、柴胡皂苷a等。柴胡根含皂苷约2%，主要皂苷为柴胡皂苷a、c及d，果实亦含多种皂苷。党参根含三萜类化合物、皂苷、多种甾醇和甾苷等。人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)和人参皂苷Rg3(ginsenoside Rg3)的混合物能阻止神经元产生过量硝酸，延缓衰老。人参皂甙可明显提高衰老模型小鼠血清中SOD及GSH-Px的活性，减少LPO及其代谢产物MDA含量，减少自由基对细胞的损伤,亦可减少脂褐质在脑、心肌中的沉积达到抗衰老的效果[21]。人参总皂苷能清除和抑制脂质过氧化，人参芦头总皂苷、茎叶总皂苷、人参果总皂苷可明显减少老年大鼠脑、心肌中LPO的生成并提高血中过氧化氢酶（CAT）的活性。此外还有绞股蓝皂苷、柴胡皂苷、甘草次酸等一些四环或五环三萜类皂苷也有类似作用[22]。
5 鞣质(Tannin)
鞣质为分子量500～3000的能沉淀生物碱、蛋白质的水溶性多酚类化合物。根据鞣质的分子结构及水解的难易可将其分为水解鞣质(hydrolysable tannins)、缩合鞣质(condensed tannins)及缩合鞣质与水解鞣质中的葡萄糖以碳健连接而成的复合鞣质(complex tannins)。约有70％以上的中药中含有鞣质类化合物。如地榆、大黄、诃子、肉桂、芒果、老鹤草及仙鹤草等含量较丰富[23]。鞣质分子中的众多酚羟基使其具有很强的还原性，对各种氧自由基、脂质自由基、含氮自由基都有较强的清除能力，比常用抗氧化剂Vit C和Vit E还强，也超过了小分子多酚如茶多酚和没食子酸。多数可水解鞣质在5μg/ml时就可显著抑制LPO升高的作用[24]。其抑制活性取决于酚羟基的位置和数目，六氢二酚羟基的清除活性大于没食子酸酚羟基。鞣质的抗氧化性还表现在抑制肝脏线粒体、微粒体的脂质过氧化作用；抑制由肾上腺素引起的脂肪细胞的脂质分解作用；降低由于肝损伤引起的肝和血清脂质过氧化物的浓度以及用过氧化油喂养的大鼠的胆固醇、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度；降低多种诱变剂的诱变性并有抗病毒活性；降低血液中尿素氮浓度和抗肿瘤、抗癌变作用[25]。
6 维生素类(Vitamins)
β┖萝卜素是维生素A的前
篇2：青春牡丹多糖对自由基清除作用的研究
青春牡丹多糖对自由基清除作用的研究
采用邻二氮菲-Fe氧化法测定了青春牡丹多糖清除羟自由基(・OH)的作用,应用邻苯三酚自氧化反应体系产生超氧阴离子自由基(O2-)的方法测定青春牡丹多糖对超氧阴离子自由基的`清除作用.结果表明,青春牡丹多糖具有清除羟自由基的作用,且呈明显的量效关系;对超氧阴离子自由基也具有清除作用.该结果提示青春牡丹多糖具有抗氧化作用.
作 者：朱月 包楠 Zhu Yue Bao Nan 作者单位：赤峰学院生命科学系,内蒙古,赤峰,024000 刊 名：赤峰学院学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF CHIFENG UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 26(2) 分类号：S685.11 关键词：青春牡丹多糖 羟自由基 超氧阴离子自由基 抗氧化作用篇3：分光光度法测定胆红素对羟自由基的体外清除作用
分光光度法测定胆红素对羟自由基的体外清除作用
次甲基蓝在662 nm处有强烈吸收,它与・OH反应后,使体系的吸光度降低.胆红素可以清除溶液中的・OH,从而使溶液吸光度下降的'程度降低.据此原理建立了一种测定胆红素对・OH清除率的新方法.确定了体系最佳实验条件为pH 8.5,次甲基蓝浓度1.6×10-5 mol・L-1,Fe2+浓度4.0×10-5mol・L-1,H2O22.56×10-5 mol・L-1,反应时间15 min以上.测定胆红素、抗坏血酸、苯甲酸清除・OH的效果,结果表明:三者对羟自由基均有较好的清除率;浓度相同时,它们对羟自由基的清除效果,苯甲酸>胆红素>抗坏血酸.
作 者：陈娟 李成方 宋功武 CHEN Juan LI Cheng-fang SONG Gong-wu 作者单位：湖北大学有机功能分子合成与应用教育部重点实验室,湖北武汉,430062 刊 名：湖北大学学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HUBEI UNIVERSITY（NATURAL SCIENCE EDITION） 年，卷(期)： 30(2) 分类号：O657.32 关键词：分光光度法 次甲基蓝 羟自由基 胆红素篇4：黄精对小鼠抗衰老作用的研究论文
黄精对小鼠抗衰老作用的研究论文
1、材料与仪器
1.1 动物昆明种雄性小鼠80只，体质量为（25±2.0）g，雌雄各半，购自泰山医学院实验动物中心。试剂：D-半乳糖购自上海试剂二厂。SOD、谷氨酸含量测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。泰山黄精采自泰山，对照黄精购自泰山医学院附属医院中药房（产地湖南）。其它常用试剂为国产分析纯。
2、方法
2.1 黄精水煎剂的制备晚秋后采挖泰山黄精的根状茎，去掉茎叶，抖尽泥沙，削去须根和烂根，用清水洗净，放在蒸笼内蒸20 min,边晒边揉至全干为止。两种黄精各500 g加蒸馏水2 500 ml煎煮30 min ,4层纱布过滤，药渣用2 000 ml蒸馏水煎煮30 min过滤，合并滤液，浓缩至2 kg/L,120℃高压灭菌，4℃冰箱保存备用[3] 。
2.2 动物分组及给药昆明种小鼠80只，适应性喂养1周后随机分为4组，即正常对照组、模型对照组、泰山黄精组和对照黄精组，每组10只。除正常对照组外，其余各组每只颈背皮下注射5% D-半乳糖0.5 ml，1次/d，连用6周，造成衰老模型。正常对照组颈背皮下注射同等剂量生理盐水。待出现衰老表征后，两个黄精实验组分别给予5，20，30 g/kg 黄精水煎液灌胃治疗，1次/d,对照组、模型组每日灌胃等量生理盐水。
2.3 脑组织SOD、谷氨酸含量以及脾脏指数的测定给药7周后，称量小鼠体重并断头处死，迅速取出小鼠脑，用冰冷生理盐水洗两次后，用滤纸拭干后称重，剪碎组织块后倒入匀浆瓶中迅速量取9倍体积的生理盐水，匀浆，制成10%的脑组织匀浆。再完整剥离小鼠脾脏和胸腺，用生理盐水洗2次后，滤纸拭干称其重量并记录。参照南京建成生物工程公司试剂盒说明书进行测定。
3、结果
与正常对照组比较，衰老模型组小鼠胸腺指数、脾脏指数明显降低（P<0.01）。两种黄精高、中、低浓度处理均能提高衰老模型小鼠的.胸腺指数和脾脏指数。泰山黄精高、中浓度处理后胸腺和脾脏指数均明显升高。与正常对照组比较，衰老模型小鼠脑组织SOD活性明显降低（P<0.01）。而谷氨酸含量则明显的升高（P<0.01）。泰山黄精高剂量组较衰老模型小鼠SOD的活性明显升高，而谷氨酸的含量明显下降（P<0.01）。对于SOD含量，泰山黄精中低以及对照黄精的高剂量组与衰老模型组对比也有显着差异。对于谷氨酸含量，泰山黄精中浓度和对照黄精高剂量组与衰老模型对比也有显着差异（P<0.05）。
篇5：几种天然黄酮类化合物对二苯代苦味肼自由基的清除作用
几种天然黄酮类化合物对二苯代苦味肼自由基的清除作用
采用循环伏安法、示差脉冲伏安法对四种天然黄酮类化合物清除二苯代苦味肼自由基(DPPH)的能力进行了探讨.研究表明:此法可直接观测样品对DPPH的清除作用,而且灵敏度高、准确可靠,是一种检测自由基及物质对其清除作用的有效方法.
作 者：庆伟霞 王勇 赵东保 李明静 刘绣华 QING Wei-xia WANG Yong ZHAO Dong-bao LI Ming-jing LIU Xiu-hua 作者单位：庆伟霞,QING Wei-xia(河南大学,医学院,河南,开封,475004)王勇,WANG Yong(河南大学,化学化工学院,河南,开封,475004)
赵东保,李明静,刘绣华,ZHAO Dong-bao,LI Ming-jing,LIU Xiu-hua(河南大学,化学化工学院,河南,开封,475004;河南省天然药物与免疫工程省重点实验室,河南,开封,475004)
刊 名：化学研究 ISTIC英文刊名：CHEMICAL RESEARCH 年，卷(期)： 20(4) 分类号：O657.1 关键词：黄酮 二苯代苦味肼自由基 循环伏安法 示差脉冲伏安法篇6：详谈贵州凤岗绿茶对小鼠抗氧化抗衰老的作用论文
详谈贵州凤岗绿茶对小鼠抗氧化抗衰老的作用论文
贵州为我国绿茶的主要省份，而凤冈产茶历史悠久。唐代茶圣陆羽在他撰写的世界第一部茶书《茶经》八之出中记述:“黔中生思州、播州、费州、夷州……，往往得之，其味极佳”。据考证，夷州治所就是今凤冈县绥阳镇。宋代《华阳国志》中“平夷产茶蜜”，乐史《太平寰宇记》“夷州、播州、思州以茶为贡”和清代《梅移随笔》“龙泉产云雾芽茶，色味双绝”中的夷州、思州、龙泉都是指今凤冈一带。最新科学研究表明，富锌富硒绿茶中所含有的天然物质成分对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等均有特殊效果，为其他茶类所不及。笔者通过测定肝脏组织中SOD 和GSH-Px 的mRNA 及其蛋白质表达水平，研究富锌富硒绿茶对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，为贵州特色茶叶产业的发展和推广提供营养保健的基础数据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料和仪器
1. 1. 1 动物。昆明雄性小鼠70 只，体重(18 ～ 25 g)，购自贵阳医学院动物中心(合格证:10000S38)。
1. 1. 2 药物。供试富硒富锌绿茶由贵州凤冈县永安镇田坝村所产， 年春季采摘。经贵州省山地研究所测试中心测定，该绿茶含锌、硒含量分别是65. 47 ± 0. 02、1. 74 ± 0. 02 mg /kg。按茶水比为2 g∶20 ml 的比例，用沸水冲泡30 min 制成茶水，过滤，为高浓度组;稀释1 倍过滤后为中浓度组;再量取等体积水稀释，过滤后为低浓度组;普通绿茶泡制方法同前;维生素C 片剂，用浓度0. 9% 生理盐水配制成50 g /ml溶液。
1. 1. 3 试剂。D-半乳糖由上海恒信化学试剂厂生产;动物组织总RNA 提取试剂盒(天根，批号DP121221);Thermo 试剂盒(Fermentas 公司);6 × DNA 电泳Loading Buffer 上样液(天根，批号BC110413);溴化乙锭(EB) 溶液( 天根，批号BC120227);DNA marker(北京康为世纪生物科技有限公司生产，批号CW0632);浓度30%丙烯酰胺(赛兰博，批号8080);1. 5 mol /L Tris(pH 8. 8);1. 0 mol /L Tris(pH 6. 8);浓度10%SDS;浓度10%过硫酸胺(APS);TEMED;BAC 法蛋白定量试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司);兔抗小鼠SOD-1 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号sc-11407);兔抗小鼠GSH-1 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号sc-292189);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Santa Cruz 公司，批号sc-)。
1. 1. 4 仪器。凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad 公司)，酶标仪(美国Bio-Tek 公司)，电泳仪( 美国Bio-Rad 公司)，3k15高速冷冻离心机(德国Sigma 公司)，T148 050-900 型PCR 仪(德国Biometra 公司)，水平电泳仪( 美国伯乐BIO-RAD 公司)，Dolphin-Doc 凝胶成像系统和Dolphin-ID 软件( 美国Wealtec 公司)，高压灭菌锅(日本三洋公司)，MP200A 型电__子天平(上海良平仪器厂)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，Morris 水迷宫(中国医学科学院药物所)，动物运动轨迹记录分析系统(普升科技有限公司)，HPLAS- 计算机图像分析系统(无憾千屏公司)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 动物衰老模型的构建。用浓度75% 乙醇消毒小鼠下腹部，用D-半乳糖(0. 2 mg /g 小鼠体重)腹腔注射，连续14d，诱发衰老模型，之后连续28 d 每日给予相同剂量以维持衰老模型。空白组小鼠注射浓度0. 9% 生理盐水(0. 1ml /10 g小鼠体重)，给药方法同模型组。
1. 2. 2 行为学测试(游泳水迷宫试验)。在连续灌胃21 d后，采用环形水池。水池中放一低于水面1 cm 左右的逃避平台。模型小鼠预先训练4 d，每次取1、2、3、4 四个象限入水点背对站台放入水池。若小鼠在60 s 内找到平台，则使其停留15 s;若60 s 内未找到平台，则将其诱导到平台上，并停留15 s 方结束一次训练。连续训练4 d，在第5 天进行行为学测试，其检测指标有:①定向航行试验，测定每只小鼠从放入水中开始到跳到逃避平台时的时间，即逃避潜伏期;②空间探索试验，测定每只小鼠穿越平台区所用时间及穿越站台次数。
1. 2. 3 分组与给药。小鼠分为空白组、衰老模型组、普通绿茶组、富锌富硒绿茶(高、中、低剂量)组、阳性对照组(维生素C 片)，每组10 只小鼠。给药方案为:给予D-半乳糖(0. 2mg /g)14 d 后，普通绿茶组给予普通绿茶茶水灌胃;富锌富硒绿茶组按照高、中、低浓度进行灌胃;模型组、空白组给予等容积蒸馏水灌胃;阳性对照组灌胃1 g /L 维生素C 溶液，1次/d，连续给药28 d。
1. 2. 4 小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px 蛋白质表达水平的检测。提取肝脏组织总蛋白，取少量上清液进行蛋白定量，余下- 20℃保存备用，制胶，然后取20 μl 蛋白质样品加上样缓冲液，煮沸变性后进行SDS-PAGE 电泳;电转移至PVDF 膜;用含浓度5%脱脂奶粉的TBST 振荡封闭2 h;分别加入适量一抗4 ℃封闭过夜，次日以TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加二抗，室温振摇孵育2 h;洗膜后ECL 法显影。以β-actin 为内参，条带经Kodok Digital Science ID Image Analysis Software 及GDS-1 数字化凝胶成像分析仪扫描，计算吸光度(A)。A 比值= 目的蛋白A/β-actinA式中，A 比值为目的蛋白表达量的相对含量。试验重复3 次，取平均值。
1. 2. 5 小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px mRNA 表达水平的检测。用动物组织总RNA 提取试剂盒提取小鼠肝脏组织总RNA，提取后取5 μl RNA 对RNA 纯度、浓度进行检测(提取方法严格按照说明书进行)。RT-PCR 引物设计依据昆明小鼠中的SOD 和GSH-PxmRNA 序列和β-actin mRNA 序列设计，经blast 进行特异性确定。最后，由上海生物工程技术服务有限公司合成引物。SOD mRNA 上游引物:5’-CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT-3’，下游引物:5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCTT-3’。该引物扩增的片段长度为221 bp。GSH-Px mRNA 上游引物:5’-GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA-3’，下游引物:5’-AGTTGCCAGACTGCTGGGACA-3’。该引物扩增的片段长度为269bp。β-actin mRNA 上游引物: 5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，下游引物: 5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。该引物扩增的片段长度为541 bp。将提取的RNA 逆转录(RT-PCR) 成cDNA，方法参考Fermentas 公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书。然后，以cDNA 为模板，以SOD、GSH-Px 和β-actin 引物分别进行PCR 反应。PCR 反应体系为:ddH2O 6 μl，2 ×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下内参各1 μl，模板2 μl。PCR 扩增反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸5 min。产物在PCR 反应结束后电泳，结果扫描保存。1. 2. 6 统计学处理。数据采用SPSS 17. 0 系统软件进行处理。计量资料采用单因素方差分析和多重比较，P < 0. 05 差异有统计学意义。
2 结果与分析
2. 1 小鼠衰老模型验证
2. 1. 1 小鼠外观。研究表明，空白组小鼠体质量正常增加;模型组小鼠从造模第28 天开始，体重增加速度下降，部分毛发脱落、失去光泽，出现行动迟缓、精神萎靡不振等症状;富锌富硒绿茶高剂量组小鼠精神状态好于普通绿茶组;富锌富硒绿茶中剂量组小鼠精神一直良好，毛发光滑整齐，体重增长速度正常;富锌富硒绿茶低剂量组小鼠精神状态略好于高剂量组小鼠;普通绿茶组小鼠表现与空白组相似;阳性组小鼠表现与中剂量组相似。
2. 1. 2 小鼠血清验证。通过对比模型组与空白对照组，发现模型组小鼠血清中MDA 含量在0. 05 水平显著升高，而血清中SOD 活力、GSH-Px 活力、过氧化氢酶(CAT) 活力显著降低。
2. 1. 3 行为学测试结果。由表1 可知，在定向航行试验中，与空白组相比，模型小鼠所用的逃避潜伏期较长(P < 0. 01);普通绿茶组所用的逃避时间与空白组相差不大(P >0. 05);与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期较短(P < 0. 01);与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组所用的逃避潜伏期与之相当(P >0. 05);与模型组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期明显缩短(P < 0. 01)。在空间探索试验中，与空白组相比，模型组第1 次穿越平台区所用时间延长，穿越站台次数明显减少，差异有统计学意义( P<0. 1=“” p=“”>0. 05); 与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组第1 次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数增多，差异有统计学意义(P < 0. 01);与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组第1 次穿越平台区所用时间和穿越站台次数与之相差不大(P >0. 05);与模型组相比，富锌富硒绿茶组第1 次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数明显增多(P < 0. 01)。
2. 2 富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px蛋白质表达水平的影响
模型组蛋白表达低于空白组，差异有统计学意义(P < 0. 01);富锌富硒绿茶高、中、低剂量组蛋白表达高于衰老模型组，差异有统计学意义(P < 0. 01);富锌富硒绿茶高剂量组蛋白表达低于低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶中剂量组蛋白表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组蛋白表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。
2. 3 富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠肝脏组织SOD、GSH-PxmRNA 表达水平的影响
模型组mRNA 表达低于空白组，差异有统计学意义(P < 0. 01);高、中、低剂量组mRNA 表达高于衰老模型组，差异有统计学意义(P<0. 01);高剂量组mRNA 表达低于低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);中剂量组mRNA 表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组mRNA 表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。
3 讨论
富锌富硒绿茶中含有锌和硒2 种微量元素。锌元素是生物体内重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的辅基;硒元素是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，每摩尔GSH-Px 含有4 g 硒原子。因此，富锌富硒绿茶可以为机体抗氧化物质提供丰富的原材料。
研究表明，SOD 和GSH-Px 是机体抗氧化系统中2 种重要的抗氧化酶。其中，SOD 对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能够有效清除自由基，减轻脂质过氧化，保护细胞免受损伤。赵会杰等通过D-半乳糖所致衰老小鼠饲喂SOD 苹果，发现可显著提高小鼠血清和肝脏组织的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，抑制脂质过氧化，降低MDA 含量。GSH-Px 则是机体内重要的分解过氧化物的含硒酶。GSH-Px 的.酶活力可以作为衡量机体硒抗氧化的能力。在体内，SOD 将超氧自由基O2- 转化为H2O2，GSH-Px 进一步将H2O2转化为H2O 和O2，并且通过减少过氧化物对SOD 的损害增加SOD 的活性。SOD 和GSH-Px 两者之间明显存在着相互保护作用和协同抗氧化作用。还有研究通过测定SOD 活性，推测其改善学习记忆作用可能与其提高体内SOD活性有关，其活力间接反映机体保护细胞免受损伤的抗氧化能力。
研究中，通过皮下注射D-半乳糖，在体内代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基O2- 和H2O2，引起代谢紊乱，进而提高体内自由基水平及过氧化体内组织制造和自然衰老类似的亚急性衰老模型。同时，以此为模型，研究贵州凤冈富锌富硒绿茶对小鼠的抗氧化作用。通过观察小鼠外观、血清学试验和行为学测试结果，发现造模成功。在小鼠行为学测试中，发现富锌富硒绿茶中剂量组的抗氧化作用最佳，提高小鼠的学习能力，延缓小鼠的衰老。
该试验结果进一步表明，富锌富硒绿茶可明显提高D-半乳糖所致衰老小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px mRNA 和蛋白质表达水平。富锌富硒绿茶可通过改变SOD、GSH-Px 的mRNA和蛋白质表达，导致小鼠肝脏和血清中SOD、GSH-Px 含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，减慢细胞衰老的速度，达到改善衰老的作用。抗氧化生化指标与水迷宫空间记忆能力试验中定向航行和空间探索试验结果相一致。另外，研究表明，中浓度富锌富硒绿茶剂量抗氧化效果更佳，原因还有待进一步研究。总之，贵州凤冈富锌富硒绿茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行为学特征，延缓衰老的进程。
篇7：中药多糖及运动抗氧化作用对糖尿病防治的研究进度论文
中药多糖及运动抗氧化作用对糖尿病防治的研究进度论文
糖尿病是常见病、多发病，严重危害着人们的身心健康。近年来，已有越来越多的研究人员发现，氧化应激和糖尿病密切相关。高血糖、高血脂等可诱发机体产生氧化应激，而活性氧( ROS) 则可导致胰岛β 细胞损伤，并影响相关信号通路等。氧化应激和糖尿病之间相互影响，造成糖尿病患者的病情不断加重，出现一系列并发症等( 糖尿病心血管病变、糖尿病肾病变) 。基于氧化应激对糖尿病患者造成的危害，现已有很多研究利用抗氧化作用来治疗或缓解糖尿病，取得了不错的效果。
本文查阅大量文献，总结分析糖尿病与氧化应激相互影响的相关机制，归纳用来检测糖尿病及其合并症中常用的氧化应激标志物，为判断糖尿病及其合并症发生发展程度提供参考依据。此外，归纳不同中药对糖尿病及其合并症抗氧化的作用，总结运动对糖尿病及其合并症抗氧化作用，为糖尿病及其合并症的防治提供参考依据。
1 氧化应激
1956 年，Harman 提出了自由基学说( free radical，FR) ，FR可与体内多种生物分子发生损伤反应，这些FR 统称为活性氧( ROS) 。正常情况下，机体内的氧化系统与抗氧化系统处于平衡状态，体内不会有过多的ROS 剩余。当机体在遭受各种有害刺激，如运动时强度过大、时间过长、面对突发事件、疾病等刺激，体内的氧化系统迅速释放信号，使高活性的ROS 大量产生，确保能提供机体充足的氧气。此时，氧化系统与抗氧化系统失衡，抗氧化系统的清除ROS 的能力远不及氧化系统释放ROS 的能力，此状态被称为氧化应激，氧化应激会造成细胞的损伤。抗氧化系统中，多种抗氧化酶和非酶系统能促进ROS 清除，主要包括超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化氢酶( CAT) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 等。
2 氧化应激与糖尿病
2. 1 糖尿病中存在氧化应激高血糖诱导产生氧化应激，其原因可能是通过线粒体电子传递链、葡萄糖氧化和多元醇通路等，长期高血糖加重氧化应激。线粒体电子传递链是产生ROS 的主要途径，葡萄糖不经过酶促反应就会形成糖基化终产物( advanced glycation end products，AEGs) ，多元醇通路主要通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( triphosphopyridinenucleotide，NAD-PH) 诱导产生氧化应激。慢性高血糖导致了线粒体电子传递链、多元醇通路紊乱，引起AEGs 含量增高，产生过多的ROS，增加了氧化应激。在陈文华等研究中，将受试者分为糖尿病组( DM) 、糖尿病合并视网膜病变组( DR) 和健康对照组，观察糖尿病及其视网膜病变患者血清抗氧化酶活性及非酶类抗氧化物、氧化应激代谢产物的水平。研究发现，糖尿病及其视网膜病变患者存在严重的氧化应激，并且糖尿病患者氧化应激代谢产物[丙二醛( MDA) 、共轭二烯( CD) 、晚期蛋白质氧化产物( AOPP) ]显著高于对照组( P < 0. 05) 。糖尿病肾病变( DN)中也存在氧化应激，何兰杰等动物实验研究中发现，高脂高糖+ 小剂量链脲佐菌素诱导的2 型糖尿病大鼠模型中，其肾脏SOD 含量下降，MDA 含量上升，出现氧化应激。此外，临床上主要通过检测DN 患者尿中DNA 氧化损伤的主要标记物8-羟基脱氧鸟苷( 8-OHdG) 来评价2 型糖尿病患者早期肾脏病变与氧化应激的关系及严重程度。硝基络氨酸( NT) 是氧化应激对蛋白质造成损伤的一个重要标志物，在1 型糖尿病患者中，往往发现NT 生成增多。李湘等研究发现糖尿病足也存在氧化应激，其氧化应激标志包括脂质过氧化物MDA、一氧化氮合酶( 总NOS 和iNOS) 活性等。除慢性高血糖外，急性的高血糖和糖尿病酮症酸中毒也可以引起明显的氧化应激。研究发现，糖尿病及糖尿病合并病发症中都存在氧化应激，引起不同的ROS 含量增高。
2. 2 氧化应激对糖尿病的影响糖尿病中存在氧化应激，而氧化应激又会对糖尿病造成更加严重的影响。ROS可以直接损伤胰岛β 细胞，胰岛β 细胞可合成线粒体锰超氧化物歧化酶( MnSOD) ，而胰岛β 细胞只合成少量的过氧化物解毒酶，ROS 含量只要稍高，就容易导致胰岛β 细胞的损伤。ROS 可作为信号分子激活一些应激敏感通路，调节相关因子的表达，引起β 细胞凋亡或坏死，抑制胰岛素分泌，诱发胰岛素抵抗，最终加重糖尿病。胰十二指肠同源盒-1( PDX-1) 是胰腺特异性表达的转录因子，主要功能调控和启动与胰岛β 细胞分化成熟及胰岛素分泌相关基因的表达。ROS可使PDX-1 含量减少，影响胰岛β 细胞的再生和分化，ROS 还可通过JNK 调控PDX-1 的表达， JNK 信号通路在转导胞外信号至核转录因子时起着重要的作用，可以提高转录的能力。ROS 激活JNK 信号通路，造成转录因子叉头框蛋白-O1( FOXO-1) 进入细胞核，而将PDX-1 挤出，最终影响了胰岛β 细胞。此外，ROS 过多可诱发炎症反应，一些炎症因子，如IL-6，CPR，TNF-α 等进一步加重胰岛素抵抗。脂肪细胞是这些炎症因子分泌并调节功能的重要场所，ROS 一方面诱发炎症因子的分泌，脂肪细胞同时加速了炎症因子的分泌，造成双重促进作用。对于肥胖型的糖尿病患者，一旦引起ROS 增多，由于其自身的肥胖造成炎症反应的加剧，导致对其糖尿病的加剧。
2. 3 糖尿病中氧化应激标志物氧化应激标志物是指能反映机体内氧化应激水平的一系列生物化学物质，本文列举了糖尿病及其合并症中主要用来检测的氧化应激标志物，见表1。本文总结了大量关于糖尿病及其合并症中的氧化应激标志物，给糖尿病临床治疗提供一定的生化指标参考依据，但是不足之处在于，目前对于以上氧化应激标志物还没有可靠的参考值。
3 中药多糖对糖尿病的抗氧化作用
中医学中虽没有“抗氧化”的说法，但是大量临床研究证明了，中药的抗氧化作用对于糖尿病的治疗也是具有较好地效果。研究发现，中药中的主要成分多糖发挥重要作用，多糖是由10 个以上单糖缩合去水，以糖苷键形式结合形成的多聚糖，与单糖、寡糖的性质不同，不但不会使血糖升高，而且能降低血糖。本文列举近几年中药多糖在糖尿病中的抗氧化作用，见表2。中药研究中，目前发现很多中药多糖对糖尿病具有抗氧化作用，主要为抗脂质过氧化，提高肝、肾、胰腺、心肌等抗氧化能力，改善糖尿病血管、视网膜病变及骨质疏松，对糖尿病溃疡、足等也有抗炎、淡化疤痕的作用。此外，中药多糖可以清除过剩自由基，修复胰岛β 细胞，抑制糖苷酶活性，延缓多糖转化为单糖等。
4 运动对糖尿病抗氧化作用
运动是一种很好的促进身体健康及疾病恢复的方式，已经被广泛推荐，当然也适用于糖尿病。运动能降低血糖和血脂，有利于糖尿病人控制血糖。此外，有规律的体育运动可以在糖尿病对抗氧化应激中起到保护作用。运动过程中，本身存在氧化应激。运动时耗氧量增加，当供氧量无法满足机体的需氧量时，机体产生ROS，如果机体无法及时清除过多的ROS，则机体会遭受氧化应激损伤。但是运动过程中，抗氧化酶的活性也会随之适应性增加，经常运动可以提高机体耐受氧化应激、清除过多ROS 的水平，这种提高取决于运动的强度、持续的时间及肌纤维的类型。一般来说，只有在耐力运动中被募集的氧化型肌纤维才能提高抗氧化酶的.活性。中小强度运动可以增强抗氧化酶的活性，提高机体抗氧化应激能力。Kiraly 等研究发现，2型糖尿病小鼠经过13周中小强度游泳训练后，其抗氧化酶活性提高，且血糖、血清胰岛素水平接近正常值。在王小娟等研究中，也得出有氧运动可增强机体抗氧化酶SOD 和GPX 活性，改善糖尿病大鼠氧化应激状态，降低其胰岛素抵抗水平。
此外，Kaczor 等研究发现，长期低强度的运动可以增加机体蛋白质相关酶的活性，减缓其氧化应激的损伤，长期运动可增加其适应性应答，从而促进细胞修复，抑制细胞凋亡。赵用强等研究发现，有氧运动可以提高有氧工作能力，促进抗氧化酶辅酶Q 清除自由基，避免DNA 中的dG 被氧化成8-OHdG，减少了DNA 的缺失和突变。Delbin 等研究发现，长期有氧运动可以降低糖尿病机体AGEs 的含量，抑制其生成，改善糖尿病血管病变。
众多研究结果显示，在选择运动方案时，中小强度的有氧运动较适合糖尿病患者，帮助其抵抗糖尿病氧化应激。运动可以降低血糖和消耗脂肪，帮助糖尿病患者抵抗氧化应激。在选择中小强度的有氧运动后( 至少30 min) ，还需注意运动后的疲劳恢复，糖尿病患者由于自身病情等原因可能导致体质下降，如果在运动后疲劳未恢复，仍进行二次运动，则导致其疲劳累积，可能加重了体内的氧化应激。因此，有规律的体育运动应当以合理的运动强度、持续时间和充分的疲劳消除为主要内容。可参考的提高糖尿病患者抗氧化能力的运动处方。
5 总结
糖尿病和氧化应激相互影响，加重糖尿病及其合并症的发展。中药和运动都能对糖尿病及其合并症抗氧化有所帮助，两者相互结合、运用更有利于糖尿病的治疗和减缓。本文中总结出的56 味中药对糖尿病及其合并症的抗氧化作用，通过服用中药对机体进行调理，能够减缓糖尿病患者的氧化应激。而运动作为常用的外治方法，对促进机体健康具有良好的作用。尤其对于糖尿病患者来说，糖尿病是一种以高血糖、高血脂为主要特征的代谢性疾病，初期形成的原因往往是饮食摄入过多，运动消耗过少引起的胰岛素抵抗和内分泌紊乱。运动能消耗过剩的能量，具有非常好的降糖、降脂功效，改善糖尿病患者高血糖、高血脂的机体内环境。因此，中药与运动结合治疗和缓解糖尿病具有一定的必要性，通过中药和运动“内调外练”减缓糖尿病患者的氧化应激，同时降低血糖和血脂等，对于防治糖尿病及其合并症有着重要意义。
中药剂量直接影响防治糖尿病及其合并症的效果，本文虽列举近几年相关的中药研究，但有关其剂量及服药时间问题还有待进一步研究。规律的体育运动对抵抗糖尿病氧化应激的保护作用应当以合理的运动强度及持续时间为主，尤其重要的，还需注意运动后的疲劳消除。
篇8：贵州凤岗富锌富硒绿茶对小鼠抗氧化抗衰老作用的讨论论文
贵州凤岗富锌富硒绿茶对小鼠抗氧化抗衰老作用的讨论论文
贵州为我国绿茶的主要省份，而凤冈产茶历史悠久。唐代茶圣陆羽在他撰写的世界第一部茶书《茶经》八之出中记述:“黔中生思州、播州、费州、夷州……，往往得之，其味极佳”。据考证，夷州治所就是今凤冈县绥阳镇。宋代《华阳国志》中“平夷产茶蜜”，乐史《太平寰宇记》“夷州、播州、思州以茶为贡”和清代《梅移随笔》“龙泉产云雾芽茶，色味双绝”中的夷州、思州、龙泉都是指今凤冈一带。最新科学研究表明，富锌富硒绿茶中所含有的天然物质成分对防衰老、防癌、抗癌、杀菌、消炎等均有特殊效果，为其他茶类所不及[2]。笔者通过测定肝脏组织中SOD 和GSH-Px 的mRNA 及其蛋白质表达水平，研究富锌富硒绿茶对D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，为贵州特色茶叶产业的发展和推广提供营养保健的基础数据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料和仪器
1. 1. 1 动物。昆明雄性小鼠70 只，体重(18 ～ 25 g)，购自贵阳医学院动物中心(合格证:10000S38)。
1. 1. 2 药物。供试富硒富锌绿茶由贵州凤冈县永安镇田坝村所产，2013 年春季采摘。经贵州省山地研究所测试中心测定，该绿茶含锌、硒含量分别是65. 47 ± 0. 02、1. 74 ± 0. 02 mg /kg。按茶水比为2 g∶20 ml 的比例，用沸水冲泡30 min 制成茶水，过滤，为高浓度组;稀释1 倍过滤后为中浓度组;再量取等体积水稀释，过滤后为低浓度组;普通绿茶泡制方法同前;维生素C 片剂，用浓度0. 9% 生理盐水配制成50 g /ml溶液。
1. 1. 3 试剂。D-半乳糖由上海恒信化学试剂厂生产;动物组织总RNA 提取试剂盒(天根，批号DP121221);Thermo 试剂盒(Fermentas 公司);6 × DNA 电泳Loading Buffer 上样液(天根，批号BC110413);溴化乙锭(EB) 溶液( 天根，批号BC120227);DNA marker(北京康为世纪生物科技有限公司生产，批号CW0632);浓度30%丙烯酰胺(赛兰博，批号8080);1. 5 mol /L Tris(pH 8. 8);1. 0 mol /L Tris(pH 6. 8);浓度10%SDS;浓度10%过硫酸胺(APS);TEMED;BAC 法蛋白定量试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司);兔抗小鼠SOD-1 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号sc-11407);兔抗小鼠GSH-1 多克隆抗体(Santa Cruz 公司，批号sc-292189);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Santa Cruz 公司，批号sc-2004)。
1. 1. 4 仪器。凝胶成像分析仪(美国Bio-Rad 公司)，酶标仪(美国Bio-Tek 公司)，电泳仪( 美国Bio-Rad 公司)，3k15高速冷冻离心机(德国Sigma 公司)，T148 050-900 型PCR仪(德国Biometra 公司)，水平电泳仪( 美国伯乐BIO-RAD 公司)，Dolphin-Doc 凝胶成像系统和Dolphin-ID 软件( 美国Wealtec 公司)，高压灭菌锅(日本三洋公司)，MP200A 型电子天平(上海良平仪器厂)，电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，Morris 水迷宫(中国医学科学院药物所)，动物运动轨迹记录分析系统(普升科技有限公司)，HPLAS-2000 计算机图像分析系统(无憾千屏公司)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 动物衰老模型的构建。用浓度75% 乙醇消毒小鼠下腹部，用D-半乳糖(0. 2 mg /g 小鼠体重)腹腔注射，连续14d，诱发衰老模型，之后连续28 d 每日给予相同剂量以维持衰老模型。空白组小鼠注射浓度0. 9% 生理盐水(0. 1ml /10 g小鼠体重)，给药方法同模型组。
1. 2. 2 行为学测试(游泳水迷宫试验)。在连续灌胃21 d后，采用环形水池。水池中放一低于水面1 cm 左右的逃避平台。模型小鼠预先训练4 d，每次取1、2、3、4 四个象限入水点背对站台放入水池。若小鼠在60 s 内找到平台，则使其停留15 s;若60 s 内未找到平台，则将其诱导到平台上，并停留15 s 方结束一次训练。连续训练4 d，在第5 天进行行为学测试，其检测指标有:定向航行试验，测定每只小鼠从放入水中开始到跳到逃避平台时的时间，即逃避潜伏期;空间探索试验，测定每只小鼠穿越平台区所用时间及穿越站台次数。
1. 2. 3 分组与给药。小鼠分为空白组、衰老模型组、普通绿茶组、富锌富硒绿茶(高、中、低剂量)组、阳性对照组(维生素C 片)，每组10 只小鼠。给药方案为:给予D-半乳糖(0. 2mg /g)14 d 后，普通绿茶组给予普通绿茶茶水灌胃;富锌富硒绿茶组按照高、中、低浓度进行灌胃;模型组、空白组给予等容积蒸馏水灌胃;阳性对照组灌胃1 g /L 维生素C 溶液，1次/d，连续给药28 d。
1. 2. 4 小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px 蛋白质表达水平的检测。提取肝脏组织总蛋白，取少量上清液进行蛋白定量，余下- 20℃保存备用，制胶，然后取20 μl 蛋白质样品加上样缓冲液，煮沸变性后进行SDS-PAGE 电泳;电转移至PVDF 膜;用含浓度5%脱脂奶粉的TBST 振荡封闭2 h;分别加入适量一抗4 ℃封闭过夜，次日以TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加二抗，室温振摇孵育2 h;洗膜后ECL 法显影。以β-actin 为内参，条带经Kodok Digital Science ID Image Analysis Software 及GDS-1 数字化凝胶成像分析仪扫描，计算吸光度(A)。A 比值= 目的蛋白A/β-actinA式中，A 比值为目的蛋白表达量的相对含量。试验重复3 次，取平均值。
1. 2. 5 小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px mRNA 表达水平的检测。用动物组织总RNA 提取试剂盒提取小鼠肝脏组织总RNA，提取后取5 μl RNA 对RNA 纯度、浓度进行检测(提取方法严格按照说明书进行)。RT-PCR 引物设计依据昆明小鼠中的SOD 和GSH-PxmRNA 序列和β-actin mRNA 序列设计，经blast 进行特异性确定。最后，由上海生物工程技术服务有限公司合成引物。SOD mRNA 上游引物:5’-CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT-3’，下游引物:5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCTT-3’。该引物扩增的片段长度为221 bp。GSH-Px mRNA 上游引物:5’-GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA-3’，下游引物:5’-AGTTGCCAGACTGCTGGGACA-3’。该引物扩增的片段长度为269bp。β-actin mRNA 上游引物: 5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，下游引物: 5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。该引物扩增的片段长度为541 bp。将提取的RNA 逆转录(RT-PCR) 成cDNA，方法参考Fermentas 公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书。然后，以cDNA 为模板，以SOD、GSH-Px 和β-actin 引物分别进行PCR 反应。PCR 反应体系为:ddH2O 6 μl，2 ×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下内参各1 μl，模板2 μl。PCR 扩增反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环，最后72 ℃延伸5 min。产物在PCR 反应结束后电泳，结果扫描保存。
1. 2. 6 统计学处理。数据采用SPSS 17. 0 系统软件进行处理。计量资料采用单因素方差分析和多重比较，P < 0. 05 差异有统计学意义。
2 结果与分析
2. 1 小鼠衰老模型验证
2. 1. 1 小鼠外观。研究表明，空白组小鼠体质量正常增加;模型组小鼠从造模第28 天开始，体重增加速度下降，部分毛发脱落、失去光泽，出现行动迟缓、精神萎靡不振等症状;富锌富硒绿茶高剂量组小鼠精神状态好于普通绿茶组;富锌富硒绿茶中剂量组小鼠精神一直良好，毛发光滑整齐，体重增长速度正常;富锌富硒绿茶低剂量组小鼠精神状态略好于高剂量组小鼠;普通绿茶组小鼠表现与空白组相似;阳性组小鼠表现与中剂量组相似。
2. 1. 2 小鼠血清验证。通过对比模型组与空白对照组，发现模型组小鼠血清中MDA 含量在0. 05 水平显著升高，而血清中SOD 活力、GSH-Px 活力、过氧化氢酶(CAT) 活力显著降低。
2. 1. 3 行为学测试结果。在定向航行试验中，与空白组相比，模型小鼠所用的逃避潜伏期较长(P < 0. 01);普通绿茶组所用的逃避时间与空白组相差不大(P >0. 05);与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期较短(P < 0. 01);与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组所用的逃避潜伏期与之相当(P >0. 05);与模型组相比，富锌富硒绿茶组所用的逃避潜伏期明显缩短(P < 0. 01)。在空间探索试验中，与空白组相比，模型组第1 次穿越平台区所用时间延长，穿越站台次数明显减少，差异有统计学意义( P<0. 1=“” p=“”>0. 05); 与普通绿茶组相比，富锌富硒绿茶组第1 次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数增多，差异有统计学意义(P < 0. 01);与阳性对照组相比，富锌富硒绿茶中剂量组第1 次穿越平台区所用时间和穿越站台次数与之相差不大(P >0. 05);与模型组相比，富锌富硒绿茶组第1 次穿越平台区所用时间缩短，穿越站台次数明显增多(P < 0. 01)。
2. 2 富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠肝脏组织SOD、GSH-Px蛋白质表达水平的影响，模型组蛋白表达低于空白组，差异有统计学意义(P < 0. 01);富锌富硒绿茶高、中、低剂量组蛋白表达高于衰老模型组，差异有统计学意义(P < 0. 01);富锌富硒绿茶高剂量组蛋白表达低于低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶中剂量组蛋白表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组蛋白表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。
2. 3 富锌富硒绿茶对衰老模型小鼠肝脏组织SOD、GSH-PxmRNA 表达水平的影响，模型组mRNA 表达低于空白组，差异有统计学意义(P < 0. 01);高、中、低剂量组mRNA 表达高于衰老模型组，差异有统计学意义(P<0. 01);高剂量组mRNA 表达低于低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);中剂量组mRNA 表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组mRNA 表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。义(P < 0. 05);中剂量组mRNA 表达高于高、低剂量组，差异有统计学意义(P < 0. 05);富锌富硒绿茶组mRNA 表达高于普通绿茶组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。护细胞免受损伤。赵会杰等通过D-半乳糖所致衰老小鼠饲喂SOD 苹果，发现可显著提高小鼠血清和肝脏组织的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，抑制脂质过氧化，降低MDA 含量。GSH-Px 则是机体内重要的分解过氧化物的含硒酶。GSH-Px 的酶活力可以作为衡量机体硒抗氧化的能力。在体内，SOD 将超氧自由基O2- 转化为H2O2，GSH-Px 进一步将H2O2转化为H2O 和O2，并且通过减少过氧化物对SOD 的损害增加SOD 的.活性。SOD 和GSH-Px 两者之间明显存在着相互保护作用和协同抗氧化作用。还有研究通过测定SOD 活性，推测其改善学习记忆作用可能与其提高体内SOD活性有关，其活力间接反映机体保护细胞免受损伤的抗氧化能力。研究中，通过皮下注射D-半乳糖，在体内代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基O2- 和H2O2，引起代谢紊乱，进而提高体内自由基水平及过氧化体内组织制造和自然衰老类似的亚急性衰老模型。同时，以此为模型，研究贵州凤冈富锌富硒绿茶对小鼠的抗氧化作用。通过观察小鼠外观、血清学试验和行为学测试结果，发现造模成功。在小鼠行为学测试中，发现富锌富硒绿茶中剂量组的抗氧化作用最佳，提高小鼠的学习能力，延缓小鼠的衰老。
该试验结果进一步表明，富锌富硒绿茶可明显提高D-半乳糖所致衰老小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px mRNA 和蛋白质表达水平。富锌富硒绿茶可通过改变SOD、GSH-Px 的mRNA和蛋白质表达，导致小鼠肝脏和血清中SOD、GSH-Px 含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，减慢细胞衰老的速度，达到改善衰老的作用。抗氧化生化指标与水迷宫空间记忆能力试验中定向航行和空间探索试验结果相一致。另外，研究表明，中浓度富锌富硒绿茶剂量抗氧化效果更佳，原因还有待进一步研究。总之，贵州凤冈富锌富硒绿茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行为学特征，延缓衰老的进程。
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