牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定
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篇1：牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定
牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定
GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用.GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起(median eminence)末端,然后进入下丘脑垂体门脉循环(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(四足动物)或直接通过轴突末梢(大多数硬骨鱼)把信号传递给刺激性腺的细胞,与特异性受体结合,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的合成与释放,参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能.伴随着GnRH的研究,研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国重要的海水养殖鱼类,本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的TypeⅠ GnRH受体,并对其组织特异性表达作了分析,为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础.在本研究中,以海水养殖牙鲆为材料,从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5'-和3'-RACE技术克隆得到了1 671 bp牙鲆促性腺激素释放激素受体(GnRH-R)全长cDNA序列,包括147 bp的5'-UTR、1 248 bp的开放阅读框和276 bp的3'-UTR,GenBank登录号是DQ011872.牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示,其存在许多保守的特征,牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域:1个N端胞外结构域(1～44个氨基酸残基)、1个大的跨膜结构域(45～324个氨基酸残基)和1个C端细胞质区域(325～415个氨基酸残基).空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的.氨基酸序列系统进化分析表明,牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性).已知的硬骨鱼GnRH-R基因的系统进化分析表明,存在两种类型的GnRH-R基因:Type Ⅰ GnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因.在牙鲆GnRH-R的氨基酸序列中,具有Type Ⅰ GnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TM Ⅲ)和DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ开始的.序列处),表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops,这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上.牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)基序,这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活;另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中(DPVIY),这个基序参与到一些GPCRs(包括GnRH-R)的内在化(internalization),同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用.在第三个胞内loop中,鱼类GnRH-R有个保守的Ala残基(在牙鲆中为Ala258),其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用.在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中,在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥,是受体的正确折叠必需的.和其他的GnRH-R一样,牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潜在的二硫桥.这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH-R对GnRH肽的选择性.GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守,但含有糖基化位点,是GnRH-Rs表达、GnRH-Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的.将mouse的GnRH-R糖基化位点引进到人GnRH-R中,可以增加受体的数量,但不影响受体结合力或肽选择性[25-26].牙鲆Type Ⅰ GnRH-R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点(N100ITV和N178VTI),牙鲆Type Ⅰ GnRH-R含有的糖基化位点比哺乳动物要多,牙鲆糖基化位点的数目是否/怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力,应该进一步研究.在牙鲆GnRH-R的第一个胞内loop中,存在1个和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一致的基序(69KRKSH74),这个基序是Gs识别基序(BBXXB,B代表碱性氨基酸,X代表任何一种氨基酸).已经证明这个基序和cAMP产生相关,cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提高stbGnRH-R在COS7细胞中的活性.和其他非哺乳动物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1个C-末端细胞内尾巴.这种胞内尾巴是鱼类GnRH-Rs功能必需的,在第三个胞内loop中,牙鲆GnRH-R含有2个PKC磷酸化位点(233SKR235和262TLK264);在C端尾巴中,存在1个PKC磷酸化位点(402TAR404).牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有鱼类GnRH-R具有的Src同源区3(SH3)结合区域(PxxP序列)(340PPAP),能够潜在地传送偶联的能力到丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),GnRH通过PKC和PKA调控GtHα和LHβ转录,二者都集中于MAPK水平.RT-PCR分析表明,GnRH-R在牙鲆脑和垂体有表达,暗示牙鲆GnRH-R参与到生殖行为如产卵行为;RT-PCR也检测到牙鲆GnRH-R在卵巢和睾丸中有表达,其能与牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表达,GnRH肽在卵巢中具有自分泌/旁分泌功能,对牙鲆卵巢中的GnRH受体可能起到调控作用.
作 者：房保海 郑法新 孙修勤 曲凌云 张进兴 FANG Bao-hai ZHENG Fa-xin SUN Xiu-qin QU Ling-yun ZHANG Jin-xing 作者单位：房保海,FANG Bao-hai(中国海洋大学,生命科学与技术学院,山东,青岛,266003;国家海洋局第一海洋研究所,山东,青岛,266061)郑法新,ZHENG Fa-xin(中国海洋大学,生命科学与技术学院,山东,青岛,266003)
孙修勤,曲凌云,张进兴,SUN Xiu-qin,QU Ling-yun,ZHANG Jin-xing(国家海洋局第一海洋研究所,山东,青岛,266061)
刊 名：中国水产科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF FISHERY SCIENCES OF CHINA 年，卷(期)： 13(4) 分类号：Q959.486 关键词：牙鲆 促性腺激素释放激素 促性腺激素释放激素受体 Paralichthys olivaceus GnRH GnRH receptor篇2：促性腺激素释放激素基因及其受体基因的研究进展
促性腺激素释放激素基因及其受体基因的研究进展
作者简要介绍了促性腺激素释放激素基因及其受体基因的位置、结构、表达、调控机理,并初步探讨了这两个基因与繁殖性能的.关系.
作 者：刘忠慧 储明星 陈国宏 LIU Zhong-hui CHU Ming-xing CHEN Guo-hong 作者单位：刘忠慧,陈国宏,LIU Zhong-hui,CHEN Guo-hong(扬州大学动物科学与技术学院,扬州,225009)储明星,CHU Ming-xing(中国农业科学院畜牧研究所,北京,100094)
刊 名：中国畜牧兽医 ISTIC PKU英文刊名：CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2006 33(3) 分类号：Q953 关键词：促性腺激素释放激素基因 促性腺激素释放激素受体基因 表达 调控机理 繁殖性能篇3：斑马鱼促性腺激素释放激素基因的克隆与表达
斑马鱼促性腺激素释放激素基因的克隆与表达
目的 克隆斑马鱼促性腺激素释放激素(GnRH)基因,构建重组质粒pQE30-GnRH并获得表达蛋白.方法 从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT-PCR方法获得斑马鱼GnRH cDNA.将该cDNA插入质粒pQE30中,并使其在大肠杆菌RB791中表达.经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳检测蛋白的表达情况.结果 斑马鱼GnRH cDNA长为207bp,编码的GnRH前体为69个氨基酸残基.与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水鲤科鱼类的氨基酸序列同源性比较,分别为74.4%,69.8%,73.3% 和 73.3%.电泳结果显示一新的分子量约为14.4 kDa的'特异蛋白带.结论 本研究所克隆的斑马鱼GnRH基因属于GnRH-Ⅱ.构建斑马鱼GnRH原核表达质粒不仅获得大量的GnRH蛋白,还可对该蛋白做进一步分离纯化以及生物活性方面的研究.
作 者：谢保胜 段瑞君 藤原滋树 Xie Baosheng Duan Rui Jun Shigeki Fujiwara 作者单位：谢保胜,段瑞君,Xie Baosheng,Duan Rui Jun(青海大学生物科学系)藤原滋树,Shigeki Fujiwara(日本高知大学理学部)
刊 名：青海医学院学报 英文刊名：JOURNAL OF QINGHAI MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)： 30(1) 分类号：Q78 关键词：斑马鱼 促性腺激素释放激素 克隆 基因表达篇4：奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与表达
奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与表达
采用RT-PCR方法从奥利亚罗非鱼丘脑中扩增出长约386 bp的目的序列GnRH/GAP,先将其克隆到T载体上,通过酶切鉴定、序列测定分析,确认序列的.正确性后,将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH/GAP,再转化到大肠杆菌TB1中,经IPTG诱导后成功表达出与预期大小相符的相对分子量约56 000的融合蛋白.
作 者：丁炜东 曹丽萍 李建林 吴婷婷 DING Wei-dong CAO Li-ping LI Jian-lin WU Ting-ting 作者单位：中国水产科学研究院,淡水渔业研究中心,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室,江苏,无锡,214081 刊 名：大连水产学院学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF DALIAN FISHERIES UNIVERSITY 年，卷(期)： 21(3) 分类号：Q786 关键词：奥利亚罗非鱼 促性腺激素释放激素 促性腺激素释放激素相关肽 基因克隆 原核表达篇5：奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究
奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用.为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRH cDNA的原核表达载体并进行融合表达.利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%.菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的.目的蛋白.目的蛋白经Factor Xa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白.以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P＜0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答.
作 者：丁炜东 曹丽萍 吴婷婷 DING Wei-Dong CAO Li-Ping WU Ting-Ting 作者单位：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室,无锡,214081 刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(4) 分类号：Q786 关键词：奥利亚罗非鱼 促性腺激素释放激素 促性腺激素释放激素相关肽 原核表达 抗体 免疫原性篇6：普通小麦中一个类受体激酶基因的克隆、鉴定和表达分析
普通小麦中一个类受体激酶基因的克隆、鉴定和表达分析
为研究抗白粉病小麦(Triticum aestivum L.)品系在小麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)侵染后有无LRK10同源基因表达,依据小麦蛋白激酶LRK10和其它植物蛋白激酶第6亚结构域设计了一个5'-RACE兼并性引物.以接种小麦白粉病菌后的小麦抗白粉病品系“99-2439”幼苗叶片cDNA为模板进行5'-RACE扩增,获得了一个1551 bp长的蛋白激酶基因cDNA片段(S1125,GenBank登录号:AY584533).此后,通过RACE技术成功地获得了该基因的.全长cDNA克隆.该克隆编码637个氨基酸组成的多肽.同源性查寻表明,该基因属于先前命名为wlrk(wheat leaf rust kinase)的小麦类受体蛋白激酶基因家族.与LRK10相似,这个新的小麦类受体蛋白激酶有5个明显的功能域:位于氨基端的疏水信号序列、推测的胞外结构域、跨膜域、高荷电序列和位于羧基端的丝氨酸/苏氨酸激酶域,因此被命名为TaLRK(Triticum aestivum LRK).以小麦肌动蛋白基因为对照,通过半定量反转录PCR(semi-QRT-PCR)技术对叶片中TaLRK基因在小麦白粉病菌接种后的转录水平表达谱进行了研究.结果表明,小麦白粉病菌的侵染使TaLRK基因的转录显著增强.组织特异性表达分析证明,这一基因仅在小麦的绿色部分表达.研究结果提示TaLRK可能参与了小麦的抗白粉病反应.
作 者：牛吉山 张丽娜 王映红 洪德锋 NIU Ji-Shan ZHANG Li-Na WANG Ying-Hong HONG De-Feng 作者单位：河南农业大学国家小麦工程技术研究中心,郑州,450002 刊 名：植物生理与分子生物学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)：2006 32(1) 分类号：Q74 关键词：小麦 类受体激酶 克隆 表达 白粉病 wheat RLK cloning expression powdery mildew【牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定】相关文章：
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